基因治疗中的DNA转运方法
李奇维 王雪梅
基因治疗是一种把基因作为药物的治疗方法，有着光明的发展前景。在今后，无论是遗传病还是获得性疾病，如癌症、AIDS、心血管疾病、感染、囊泡纤维症、SCID等，都可能被基因疗法治愈。简单来说，基因治疗就是通过替代补充受损的基因或缺失的基因从而表达缺失的蛋白。各种类型的基因材料都有应用，如双链DNA、单链DNA、质粒等。然而，由于DNA对介质中的核酸酶很敏感容易降解以及DNA有着大尺寸和负电性使其难以通过被动运输过膜。因此，DNA必须和输运系统或者载体相结合，保证其能成功过膜并在细胞内表达，不被核酸酶降解。理想的转染系统，应该具有以下这些特征：不能引起强烈的免疫反应；能运输各种大小的核酸；运输的核酸能稳定的表达；对靶细胞需具有良好的特异性，尤其是对那些在体内分布不集中的靶细胞（如白血病）；既能转染分裂期细胞，又要能转染非分裂期细胞；制备廉价，能高浓度保存；能使导入的基因作为附加基因存在或是整合到染色体的特定位置而非随机插入染色体中。转染方法一般来说可以分为两大类，一类是利用一些特殊仪器将基因以物理的力削弱细胞膜增加其通透性的方式导入；另一类是使用载体来进行转染，载体又分为病毒载体和非病毒载体。下面我们将对目前基因治疗中的DNA转运方法进行简单综述和展望。
1. 物理方法
电穿孔：也称作电增透或电转染。电穿孔转染的原理是使用强的交流电场（通常是上百伏的电脉冲），改变细胞膜的通透性和局部稳定性，从而增强细胞对DNA的摄取。这项技术最早是在1982年的时候由诺依曼的研究组使用并提出的，他们使用电脉冲将DNA注入鼠细胞。这项技术已经成功的应用于多种不同种类的组织，如皮肤、肌肉、肝脏和肿瘤。但电脉冲基因转染技术的效果受很多因素的制约和影响，如脉冲持续时间、电场强度、电极尺寸，细胞的尺寸、形状、密度等。虽然电穿孔技术有着诸如安全、高效、可重复性好等诸多优点，但使用它作为活体的转染方法还有着诸多问题。首先，由于使用电穿孔进行转染时电极间距通常在1cm左右，很难对较大空间内的组织进行转染；其次，需要使用手术才能在体内安置电极，操作复杂难度高；最重要的是，在电刺激过程中，高电压可能会对组织造成永久性损伤。为了解决这些问题，也已开展了不少研究，例如通过改变电极形状来更好的适配需要转染的区域减小局部的大电流减小对组织的损伤，调节场强、持续时间以及频率来降低损伤风险减小电荷堆积等手段提高安全性。
基因枪：基因枪技术是目前最先进有效的物理基因转染技术之一。顾名思义，这种技术通过加速附着有遗传物质的微米级靶丸（通常是生物惰性的重金属颗粒，如钨、金、银等），撞击靶细胞，使表面的遗传物质脱落并在细胞中表达。这种技术最早由桑佛德和他的同事于1987年提出并使用，最早仅用于植物细胞，随着技术发展，逐渐扩展到哺乳动物细胞。基因枪技术转染的基因在大部分靶细胞内能在数小时内开始表达并持续表达较长时间，且能精确的靶向如肝脏、心脏、大脑和肌肉等器官。但由于原理所限，这种技术不具有强的穿透力，难以转染较大区域内的组织或器官，并且对深埋在体内的器官进行转染时同电穿孔一样，需要通过手术才能完成。由于以上特点，基因枪技术仅在基因疫苗、免疫疗法以及使用自杀基因治疗癌症等领域里最为活跃。
超声：声波在液体中传播时，由于空化效应使细胞膜受到液体冲击，诱使产生了声致穿孔现象。进而改变细胞膜的通透性，增加了细胞对基因的摄取，原理上有些类似电穿孔方法，不过是使用声波代替电脉冲来完成增透。超声法最早是二十世纪九十年代提出并使用来对DNA体外转染进行调节，目前广泛应用于体内各种组织与器官(如肌肉、肝脏、肾脏、心脏等)和肿瘤，最近还被用来进行透皮给药。超声法具有安全、非侵入性以及不进行手术即可对体内器官进行处理的特点。超声转染法是通过空化作用对细胞进行增透处理，因此，作为影响空化作用的两个主要参数，即频率和功率，很大程度上决定着超声转染的效率。简单来说，频率越高，空化作用越弱，方向性越好；功率越大，空化效应越强，组织损伤越大。因此，利用聚焦超声来实现局部精准治疗与转染是超声法的发展趋势。另外，加入超声成像增强剂能大大提升转染效果，这是由于增强剂通常包含气泡，而空化作用会由于这些气泡作为汽化核而大大增强。
高压注射：高压注射技术是指短时间内（3-5s）通过静脉向生物体内注射大量（8-9%体重）高浓度DNA溶液从实现转染的技术。这种方法最早在1996年由巴斯克和他的研究组提出并使用的。由于注入速率过快远远超过了安全限，可能导致心力衰竭或心肌梗塞等致死疾病，这种方法不适用于人类。又由于其简便易行，这种技术广泛应用于啮齿类动物的转基因研究上，尤其是肝脏相关的研究。
2. 病毒型载体
病毒是能进入宿主细胞核并且利用细胞机器表达自己的基因进行自我复制并扩散到别的细胞的生命体。研究人员已经成功使用了不同的病毒来运输治疗基因进入细胞核进行表达。用来进行转运基因的病毒，都经过了基因工程的改造。移除致病基因，取而代之的是治疗基因，保留了其非致病的结构（包膜蛋白，融合蛋白等）使其能和细胞相作用但不会致病。这些携带治疗基因却并不致病的病毒被称为病毒载体。由于病毒载体的高转染效率，到目前为止，病毒载体是基因治疗中使用最多的转染手段。当然，它也有很多不足之处，如：病毒型载体可能产生严重的免疫反应；大量制备病毒载体既困难又昂贵；病毒载体携带的基因长度有限等。通常用来作为载体的病毒有反转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒和单纯疱疹病毒。下面对每种病毒载体的优缺点进行简单的介绍。
腺病毒：具有很高的滴度，在体外和体内实验中都显示出了很好的转染效率，对增值的和休眠期的细胞都能进行转染，能够制成高浓度制剂。缺点在于，作为附加的基因并不整合到基因组里，因此只能在短时间内表达。反复注射，可能会引起免疫反应。且腺病毒具有潜在的复制能力，没有靶向能力，基因尺寸也有严格的限制，不能大于4-5kb。
腺相关病毒:腺相关病毒能将基因整合到细胞的第19号染色体上，因此能在细胞中长期表达，无论细胞是否在分裂期，都能进行转染，并且它的基因组很小，没有病毒基因。不足之处在于我们对腺病毒的认识还很少，很多机理并不清楚，有着潜在的风险。由于腺病毒是将基因正好到染色体上，因此有一定突变的可能性。另外，要制作高滴度的试剂非常困难。同腺病毒类似，没有靶向能力，基因尺寸不能大于5kb。
单纯疱疹病毒:单纯疱疹病毒能运载的基因尺寸非常大，约40-50kb。它趋向于感染神经细胞，并潜伏表达，在体内具有很高的转染能力，并且可以通过设计使其具有复制能力。虽然有着以上令人瞩目的优点，但单纯疱疹病毒不具有靶向性，且有细胞毒性，导入的基因不能长时间表达且滴度中等。
慢病毒:具有相对较高滴度，且无论细胞是否处于增值中，都能转染。值得一提的是，慢病毒会转染造血干细胞延长导入基因的表达。但慢病毒的出身决定了其安全性值得让人担忧，来自于HIV。无论是制备还是保存都很困难。能携带的基因尺寸也有限，仅8kb。相应的临床相关经验也相对缺乏。
反转录病毒：反转录病毒能整合进细胞的基因组，能感染种类繁多的细胞并持续稳定表达。它还具有相对较高的滴度和导入尺寸（9-12kb）。由于反转录病毒的基因插入是随机的，最终导入的基因可能被沉默掉，或导致了不希望见到的基因突变。并且，反转录病毒只能感染分裂期的细胞，不具有靶向性，载体具有潜在的复制能力。
3. 非病毒载体：
由于病毒载体可能诱发强烈的免疫反应，非病毒载体作为更安全的替代品日益引起了人们的兴趣。与病毒载体相比非病毒载体具有安全、低免疫源性、廉价、易大量制备的优点，但较低的转染效率限制了其实际应用。非病毒载体要实现转染功能，不仅要对DNA形成保护，使其在运输途中不会被降解，还要将其压缩使其容易通过核孔。DNA和载体通常是通过自组装的方式结合在一起，形成纳米级复合物。这些纳米复合物在血液中的状态很大程度上取决于其粒径。我们已清楚地了解到当静脉注射的粒径大于100nm时，很有可能被分布于肝、脾、肺与骨髓的网状内皮系统捕获（RES），并激活单核白细胞与巨噬细胞使其降解。当粒径小于几纳米时，将被肾脏滤除体外。与普通的血管相比，瘤组织血管形状特殊且有缺陷，具有较大的孔径。使用大于普通血管可通过尺寸的纳米粒子（从几纳米到150纳米）可以帮助载体进入肿瘤组织。
脂质体是把水加入干燥的脂质膜时生成的磷脂双分子结构，其直径范围从亚微米到几微米。他们可以把溶于水的、不溶于水的、治疗性蛋白质、siRNA或DNA都包含进他们的亲水的或疏水的隔间内。一些基于脂质体的用途不同的治疗方案已经被批准。又如1,2-二油酸甘油-3-甲酸-丙烷(DOTAP)和N-[1-(2,3-二油酸甘油)丙基]-N,N,三甲基-甲基硫酸铵盐 (DOTMA)的阳离子脂质体，由于能由静电作用和核酸形成脂质复合物，是一种很有吸引力的介质。不过虽然在体外实验中它们效果不错，但在体内却引起了很强的type I与type II型干扰素反应。阳离子聚合物脂质体可以引起与治疗基因无关的基因表达改变，增加了对其安全性的担忧。另外，阳离子聚合物也表现出了和计量相关的毒性并且引起肺部炎症（氧化反应的中间产物引起的）。由于这种效应和电荷有关，电中性的1,2-二油酸甘油-sn甘油基-3-磷脂酰胆碱 (DOPC)可以避免这种毒性。在生物组织中，这些纳米粒子的运输效率是DPOTAP的十倍，并且至今没有观察到毒性。带负电的脂质体也会诱发免疫反应并被同样带负电的细胞膜排斥。别的脂质或胆固醇组成，例如聚合物电解质复合物与聚乙烯亚胺形成的胶粒，也能有效地运送DNA并且检测不到IFNα反应。把DNA与作为高密度脂蛋白或低密度脂蛋白结合也能将其有效的运输到指定组织。由于同B类和I型吞噬受体的密切关系，高密度脂蛋白修饰的DNA主要被肝、肾上腺、卵巢和肾吸收。而低密度脂蛋白由于其相应受体的表达，其修饰的DNA主要进入肝脏。另一种由氨基丙烯酸酯和氨基丙烯酰胺构成的类脂脂类复合物被称为类脂分子载体，在老鼠和猕猴中也表现出良好的相容性。这些改进方法不仅有着良好的相容性，且有着更高的转染效率，最终提高治疗指数。
天然的以及人工合成的生物相容性优良的聚合物载体也具有潜在的应用前景。与脂类相似，其阳离子基质与带负电的DNA产生静电相互作用并允许DNA进入。树状的天然的聚合物PEI，以及壳聚糖、环糊精和胶原蛋白等，是目前正在开发的更有前途的合成聚合物。尽管PEI具有高转染率并能通过质子海绵效应缓冲胞内酸碱度，但还是能在细胞内外观察到一些毒性。为实现临床使用前能够接受的毒性要求，需要对其进行化学修饰改性。树状结构由一个核心分子和延伸出的枝干构成，早期的树状分子（如聚酰胺）的细胞毒性是由细胞膜穿孔、稀释和溶解造成的细胞膜破坏引起的。对这些载体进行表面修饰后，生物相容性得到了提高。壳聚糖是由几丁质脱去乙酰基形成的，是一种在昆虫和甲壳类体内大量存在的黏多糖。由于其成本低、生物可降解、没有免疫源性以及高的运输效率使其成为一种合适的载体。目前为止，老鼠体内的活体毒性实验显示对其有良好的耐受性。带有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸的壳聚糖对肿瘤的特异性最近也得到了证实，由于这些微粒的特异性能准确靶向到与肿瘤相关的上皮细胞。环糊精是有着双亲结构的葡萄糖环形低聚物。这种制剂只会引起白介素和干扰素水平反应，在高剂量计量时导致肝脏和肾脏功能紊乱。去端胶原是一种不会引起端肽免疫反应的高度纯化的I型胶原，有很多临床效用，如创伤修复和血管的生物弥补，当和DNA结合成纳米粒子后，它也具有高运输效率和低免疫原性。
至于传统的纳米材料，如碳纳米管、功能化铁氧化物等进行也能作为潜在载体完成DNA的输运。
综上所述，由于基因治疗具有医治众多传统化学药物难以应对的疾病的巨大潜力，尽管还有着重重阻碍，使其仍在很长一段时间内是研究的热点。如何将基因高效地导入靶细胞并持续稳定的表达，一直是基因治疗技术的难点且进展缓慢。到目前为止，无论在体还是离体，病毒载体依旧是最高效的载体。我们在进一步了解病毒转染机制的同时对病毒进行更深入的工程化改造使其更加安全，也应该模仿病毒的策略来对非病毒载体进行改进，增加其转染效率。物理转染法的高效性与便捷性使其在疫苗或实验室中将有一席之地。未来多种基因输运方法将并存发展逐渐完善，使基因治疗的未来更加美好、前景广阔。
